Доступ открыт Открытый доступ  Доступ закрыт Только для подписчиков

ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОАКТИВНОЙ ГЛУТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗЫ Р1-1 ИЗ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ АФФИННЫХ МЕМБРАН И СВОЙСТВА ОЧИЩЕННОГО ФЕРМЕНТА

Полный текст:


Аннотация

Глутатион-S-трансфераза Р1-1 (GSTP1-1) человека является диагностически важным ферментом, гиперэкспрессия которого в опухолях и лимфомах приводит к формированию множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Небольшие количества фермента можно выделить из эритроцитов, однако известные методы очистки не позволяют получить препараты с высокой удельной активностью и хорошим выходом. С целью разработки более эффективной процедуры очистки эритроцитарной GSTP1-1 в настоящей работе впервые получены и охарактеризованы глутатионсодержащие аффинные мембраны на основе химически модифицированной целлюлозной бумаги. Мембраны успешно использованы для очистки фермента вместо традиционных агарозно-гелевых адсорбентов. Разработан новый метод выделения и очистки GSTP1-1 из гемолизата эритроцитов, включающий предварительное удаление гемоглобина на анионообменнике и аффинную хроматографию фермента на картридже с глутатионсодержащими мембранами. По эффективности (выход фермента 76,5 %, степень очистки 23589 раз, удельная активность 104,5 Ед/мг белка) предложенный метод значительно превосходит ранее опубликованные. Гомогенность полученного препарата, по данным гель-электрофореза и масс-спектрометрии, составляет не менее 95%. Найдены стационарные кинетические параметры очищенной GSTP1-1 в реакции конъюгации глутатиона (GSH) и 1-хлор-2,4- динитробензола (CDNB) при рН 6,5 и 25 °С: для GSH Km = 0,19 мМ, kcat = 47,8 с–1; для CDNB Km = 0,68 мМ, kcat = 54,3 с–1. Результаты работы представляют интерес для скрининга новых ингибиторов фермента с противоопухолевой активностью. Полученные аффинные мембраны могут быть использованы при выделении нативных и рекомбинантных глутатион-S-трансфераз (GST) из различных источников, а также гибридных белков с GST-доменом. 


Об авторах

С Н. Гилевич
Институт биоорганической химии НАН Беларуси
Беларусь
канд. хим. наук, вед. науч. сотрудник


Ю. В. Бречко
Институт биоорганической химии НАН Беларуси
Беларусь
мл. науч. сотрудник


К. Ю. Рипинская
Институт биоорганической химии НАН Беларуси
Беларусь
мл. науч. сотрудник


Список литературы

1. Hayes, J. D. Glutathione transferases / J. D. Hayes, J. U. Flanagan, I. R. Jowsey // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 2005. – Vol. 45. – P. 51–88.

2. Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death / E. Laborde // Cell Death Differ. – 2010. – Vol. 17, № 9. – P. 1373–1380.

3. Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective / A. Oakley // Drug Metab. Rev. – 2011. – Vol. 43, №2. – P. 138–151.

4. Townsend, D. M. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance / D. M. Townsend, K. D. Tew // Oncogene. – 2003. – Vol. 22, № 47. – P. 7369–7375.

5. Erythrocyte glutathione transferase: a novel biomarker to check environmental pollution hazardous for humans /

6. R. Fabrini [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2012. – Vol. 426, № 1. – P. 71–75.

7. Dissociation of a new glutathione S-transferase activity in human erythrocytes / K. R. Schröder [et al.] // Biochem. Pharmacol. – 1992. – Vol. 43, № 8. – P. 1671–1674.

8. The human glutathione S-transferases. Studies on the kinetic, stability and inhibition characteristics of the erythrocyte enzyme / P. A. Hirrell [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. – 1987. – Vol. 913, № 1. – P. 92–96.

9. Awasthi, Y. C. Purification and characterization of a new form of glutathione S-transferase from human erythrocytes / Y. C. Awasthi, S. V. Singh // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1984. – Vol. 125, № 3. – P. 1053–1060.

10. Howie, A. F. Purification of acidic glutathione S-transferases from human lung, placenta and erythrocyte and the development of a specific radioimmunoassay for their measurement / A. F. Howie, J. D. Hayes, G. J. Beckett // Clin. Chim. Acta. – 1988. – Vol. 177, № 1. – P. 65–76.

11. Purification and biochemical characterization of glutathione S-transferase from Down syndrome and normal children erythrocytes: a comparative study / R. R. Hamed [et al.] // Res. Dev. Disabil. – 2011. – Vol. 32, № 5. – P.1470–1482.

12. Marcus, C. J. Glutathione transferase from human erythrocytes. Nonidentity with the enzymes from liver / C. J. Marcus, W. H. Habig, W. B. Jakoby // Arch. Biochem. Biophys. – 1978. – Vol. 188, № 2. – P. 287–293.

13. Electron paramagnetic resonance identification of a highly reactive thiol group in the proximity of the catalytic site of human placenta glutathione transferase / A. Desideri [et al.] // J. Biol. Chem. – 1991. – Vol. 266, № 4. – P. 2063–2066.

14. Vander Jagt, D. L. Purification and bilirubin binding properties of glutathione S-transferase from human placenta / D. L. Vander Jagt, S. P. Wilson, J. E. Heidrich // FEBS Lett. – 1981. – Vol. 136, № 2. – P. 319–321.

15. Cytoplasmic and periplasmic production of human placental glutathione transferase in Escherichia coli / A. Battistoni [et al.] // Protein Expr. Purif. – 1995. – Vol. 6, № 5. – P. 579–587.

16. High-level bacterial expression of human glutathione transferase P1-1 encoded by semisynthetic DNA // R. H. Kolm [et al.] // Protein Expr. Purif. – 1995. – Vol. 6, № 3. – P. 265–271.

17. Zou, H. Affinity membrane chromatography for the analysis and purification of proteins / H. Zou, Q. Luo, D. Zhou // J. Biochem. Biophys. Methods. – 2001. – Vol. 49, № 1–3. – P. 199–240.

18. Гилевич, С. Н. Аффинные мембраны на основе химически модифицированной целлюлозы для избирательной твердофазной экстракции белков / С. Н. Гилевич, Е. Ю. Завизион // Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии: Нац. акад. наук Беларуси, Ин-т химии новых материалов; науч. ред. В. Е. Агабеков, Е. В. Королева, К. Н. Гусак. – Минск, 2011. – С. 305–319.

19. Гилевич, С. Н. Получение и гемоглобинсвязывающие свойства металлоаффинных мембран на основе химически модифицированной хроматографической бумаги / С. Н. Гилевич, Е. Ю. Завизион // Химия, структура и функция биомолекул: материалы IV Междунар. конф., Минск, 17–19 окт. 2012 г. / Институт биоорганической химии НАН Беларуси; редкол.: С. А. Усанов [и др. ]. – Минск, 2012. – С. 46–47.

20. Forde, G. M. Preparation, analysis and use of an affinity adsorbent for the purification of GST fusion protein / G. M. Forde // Methods Mol. Biol. – 2008. – Vol. 421. – P. 125–136.

21. Burton, S. C. High-density ligand attachment to brominated allyl matrices and application to mixed mode chromatography of chymosin / S. C. Burton, D. R. K. Harding // J. Chromatogr. A. – 1997. – Vol. 775, № 1–2. – P. 39–50.

22. Preparation of the immobilized metal affinity membrane with high amount of metal ions and protein adsorption efficiencies / Y. M. Ke [et al.] // Process Biochem. – 2010. – Vol. 45, № 4. – P. 500–506.

23. Scoble, J. A. Assay for determining the number of reactive groups on gels used in affinity chromatography and its application to the optimisation of the epichlorohydrin and divinylsulfone activation reactions / J. A. Scoble, R. K. Scopes // J. Chromatogr. A. – 1996. – Vol. 752, № 1–2. – P. 67–76.

24. Friedman, M. Applications of the ninhydrin reaction for analysis of amino acids, peptides, and proteins to agricultural and biomedical sciences / M. Friedman // J. Agric. Food Chem. – 2004. – Vol. 52, № 3. – P. 385–406.

25. The Molecular Mechanism of Autoxidation for Human Oxyhemoglobin / M. Tsuruga [et al.] // J. Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273, № 15. – P. 8607–8615.

26. Habig, W. H. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation / W. H. Habig, M. J. Pabst, W. B. Jakoby // J. Biol. Chem. – 1974. – Vol. 249, № 22. – P. 7130–7139.

27. Bisswanger H. Practical Enzymology / H. Bisswanger – 2nd Ed. – Weinheim: Wiley-Blackwell, 2011. – 378 p.

28. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 5259. – P. 680–685.

29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72, № 1–2. – P. 248–254.

30. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes / J. Credou [et al.] // J. Mater. Chem. B. – 2013. – Vol. 1, № 26. – P. 3277–3286.

31. Catalytically active monomer of glutathione S-transferase pi and key residues involved in the electrostatic interaction between subunits / Y. C. Huang [et al.] // J. Biol. Chem. – 2008. – Vol. 283, № 47. – P. 32880–32888.

32. Inactivation of human salivary glutathione transferase P1-1 by hypothiocyanite: a post-translational control system in search of a role / R. Fabrini [et al.] // PLoS One. – 2014. – Vol. 9, № 11. – e112797.

33. Monomer-dimer equilibrium in glutathione transferases: a critical re-examination / R. Fabrini [et al.] // Biochemistry. – 2009. – Vol. 48, № 43. – P. 10473–10482.

34. Study of chromatographic parameters for glutathione S-transferases on an high-performance liquid chromatography affinity stationary phase / J. B. Wheatley [et al.] // J. Chromatogr. A. – 1994. – Vol. 676, № 1. – P. 81–90.

35. Effect of linker for immobilization of glutathione on BSA-assembled controlled pore glass beads / L.-H. Chen [et al.] // Bull. Korean Chem. Soc. – 2004. – Vol. 25, № 9. – P. 1366–1370.

36. Mannervik, B. Glutathione Transferase (Human Placenta) / B. Mannervik, C. Guthenberg // Meth. Enzymol. – 1981. – Vol. 77. – P. 231–235.

37. Thumser, A. E. Kinetic mechanism of human erythrocyte acidic isoenzyme ρ / A. E. Thumser, K. M. Ivanetich // Biochim. Biophys. Acta. – 1993. – Vol. 1203, № 1. – P. 115–120.

38. Studies on the variability of glutathione S-transferase from human erytrocytes / R. C. Strange [et al.] // Clin. Chim. Acta. – 1982. – Vol. 120, № 2. – P. 251–260.

39. Forman, H. J. Glutathione: overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis // H. J. Forman, H. Zhang, A. Rinna // Mol. Aspects Med. – 2009. – Vol. 30, № 1–2. – P. 1–12.

40. Purification of glutathione S-transferase pi from erythrocytes and evaluation of the inhibitory effect of hypericin / S. Turk [et al.] // Protein J. – 2015. – Vol. 34, № 6. – P. 434–443.


Дополнительные файлы

Просмотров: 14

Обратные ссылки

  • Обратные ссылки не определены.


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

ISSN 1561-8331 (Print)