vestichИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия химических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Chemical Series1561-83312524-2342The Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"vestich-272Research ArticleБИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯBIOORGANIC CHEMISTRYДУБЛЕР-КРАСИТЕЛИ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ДНК-ЗОНДОВ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕENHANCING THE FLUORESCENCE OF DNA-PROBES FOR MOLECULAR DIAGNOSTICSМартыненко-МакаевЮ. В.Martynenko-MakaevY. V.

магистр хим. наук, мл. науч. сотрудник, аспирант

M. Sc. (Chemistry), Junior researcher, Ph. D. student

yrmart@gmail.comБрылёвВ. А.BrylevV. A.

аспирант

Ph. D. student

УдодоваВ. В.UdodavaV. V.

магистрант, мл. науч. сотрудник

Master student, Junior researcher

vika.udodova@tut.byИнститут физико-органической химии НАН БеларусиInstitute of Physical Organic Chemistry of the National Academy of Sciences of BelarusИнститут биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАНShemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences201707102017037278Copyright © Мартыненко-Макаев Ю.В., Брылёв В.А., Удодова В.В., 20172017Мартыненко-Макаев Ю.В., Брылёв В.А., Удодова В.В.Martynenko-Makaev Y.V., Brylev V.A., Udodava V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestichem.belnauka.by/jour/article/view/272

Современная молекулярная диагностика, основным методом которой является полимеразная цепная реакция (ПЦР), широко используется для выявления различных заболеваний и контроля за их протеканием. Наибольшую популярность в наше время получили флуоресцентно-меченные ДНК-зонды, обладающие высокой чувствительностью и простотой использования. Наиболее важной характеристикой флуоресцентно-меченных ДНК-зондов является интенсивность флуоресценции. Увеличение интенсивности флуоресценции позволяет повысить чувствительность проводимых исследований. Увеличение интенсивности флуоресценции возможно путем множественного введения флуорофоров на специальных жесткокаркасных линкерах. В данной работе в качестве жесткокаркасного линкера были использованы производные 3,5-диаминобензойной кислоты. Таким образом, в работе описан синтез реагентов-разветвителей на основе 3,5-диаминобензойной кислоты, а также получение их производных, несущих по две молекулы карбоксифлуоресцеина, а также фосфорамидитную либо азидную функцию для введения метки в олигонуклеотиды при помощи автоматического твердофазного синтеза или [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения. Показано, что полученные при помощи реагентов ДНК-зонды обладают практически двух- кратным увеличением интенсивности флуоресценции и улучшенными фотофизическими характеристиками.

 

Modern molecular diagnostics with polymerase chain reaction (PCR) is widely used as a basic tool for detection of various diseases and control of their course. Today the fluorescently labeled DNA-probes have the greatest popularity due to their high sensitivity and ease of use. Fluorescence intensity is the most important characteristic of fluorescently labeled DNA-probes. Increase of fluorescence intensity will enhance the sensitivity of analysis. Fluorescence intensity can be increased by multiple introduction of fluorophores based on special rigid linkers. Therefore the derivatives of 3,5-diaminobenzoic acid were used. In this paper we report on the synthesis of linkers based on 3,5-diaminobenzoic acid and their application in synthesis of the reagents with two fluorescein fluorophores and phosphoramidite or azide function for introduction of label into oligonucleotides. It is shown that obtained DNA-probes have almost twofold increase of fluorescence intensity and improved photophysical characteristics.

реагенты-разветвителифлуоресценциядублер35-диаминобензойная кислотафлуоресцеинПЦРПЦР-РВусиление флуоресценцииbranching reagentsfluorescencedoubler35-diaminobenzoic acidfluoresceinPCRPCR-RTfluorescence enhancementReferencesПЦР «В реальном времени» / Д. В. Ребриков [и др.]. – М., БИНОМ, 2009.Rebrikov D. V., Samatov G. A., Trofimov D. Iu., Semenov P. A., Savilova A. M., Kofiadi I. A., Abramov D. D., PTsR v real’nom vremeni [Real-time PCR], in Rebrikov D. V. (ed.), 2nd ed., BINOM. Laboratoriia znanii, Moscow, RU, 2009.Wilson, J. N. Efficient Quenching of Oligomeric Fluorophores on a DNA Backbone / J. N. Wilson, Y. N. Teo, E. T. Kool // J. Am. Chem. Soc. – 2007, Vol. 129. – P. 15426–15427.Wilson J.N., Teo Y.N., Kool E.T., “Efficient Quenching of Oligomeric Fluorophores on a DNA Backbone”, Journal of the American Chemical Society, 2007, vol. 129, pp. 15426–15427.Synthesis of dye/fluorescent functionalized dendrons based on cyclotriphosphazene / A. Hameau [et al.] // Beilstein journal of organic chemistry. – 2011. – Vol. 7, №. 1. – P. 1577–1583.Hameau A., Fuchs S., Laurent R., Majoral J.-P., Caminade A.-M., “Synthesis of dye/fluorescent functionalized dendrons based on cyclotriphosphazene”, Beilstein journal of organic chemistry, 2011, vol. 7, no. 1, pp. 1577–1583.Labeling of antibodies with Cy3-, Cy3. 5-, Cy5-, and Cy5. 5-monofunctional dyes at defined dye/protein ratios / C. D. Hahn, C.K. Riener, H.J. Gruber // Single Molecules. – 2001. – Vol. 2, №. 2. – P. 149–159.Hahn C. D., Riener C. K., Gruber H. J., “Labeling of antibodies with Cy3-, Cy3. 5-, Cy5-, and Cy5. 5-monofunctional dyes at defined dye/protein ratios”, Single Molecules, 2001, vol. 2, no. 2, pp. 149–159.Martin, V. V. Amplified fluorescent molecular probes based on 1, 3, 5, 7-tetrasubstituted adamantine / V. V. Martin, I. S. Alferiev, A. L. Weis // Tetrahedron letters. – 1999. – Vol. 40, № 2. – P. 223–226.Martin V. V., Alferiev I. S., Weis A. L., “Amplified fluorescent molecular probes based on 1, 3, 5, 7-tetrasubstituted adamantine”, Tetrahedron letters, 1999, vol. 40, no. 2, pp. 223–226.Misra, A. Synthesis and Fluorescence Studies of Multiple Labeled Oligonucleotides Containing Dansyl Fluorophore Covalently Attached at 2′-Terminus of Cytidine via Carbamate Linkage / A. Misra, S. Mishra, K. Misra // Bioconjug. Chem. – 2004. – Vol. 15. – P. 638–646.Misra A., Mishra S., Misra K., “Synthesis and Fluorescence Studies of Multiple Labeled Oligonucleotides Containing Dansyl Fluorophore Covalently Attached at 2′-Terminus of Cytidine via Carbamate Linkage”, Bioconjugate Chemistry, 2004, vol. 15, pp. 638–646.Титце, Л. Препаративная органическая химия. Реакции и синтезы в практикуме органической химии и научно-исследовательской лаборатории / Л. Титце, Т. Айхер. – М.: Мир, 1999. – 704 с.Tietze L., Eicher T., Preparativnaia organicheskaia khimiia. Reaktsii i sintezy v praktikume organicheskoi khimii i nauchno-issledovatel’skoi laboratorii [Preparative organic chemistry. Reactions and syntheses in the workshop of organic chemistry and research laboratory], Mir, Moscow, RU, 1999.Novel Non-Nucleosidic Building Blocks for the Preparation of Multilabeled Oligonucleotides / A. Guzaev [et al.] // Bioconjugate Chem. – 1996. – Vol. 7. – P. 240–248.Guzaev A., Salo H., Azhayev A., Lönnberg H., “Novel Non-Nucleosidic Building Blocks for the Preparation of Multilabeled Oligonucleotides”, Bioconjugate Chemistry, 1996, vol. 7, pp. 240–248.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.