vestichИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия химических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Chemical Series1561-83312524-2342The Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1561-8331-2018-54-2-197-203vestich-321Research ArticleБИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯBIOORGANIC CHEMISTRYКОНТРОЛИРУЕМОЕ ПЕГИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ АЗИДНЫМИ РЕАГЕНТАМИ-РАЗВЕТВИТЕЛЯМИ С ПОМОЩЬЮ КЛИК-ХИМИИCONTROLLED CuAAC PROTEIN PEGYLATION WITH AZIDE BRANCHING REAGENTSМартыненко-МакаевЮ. В.Martynenko-MakaevYu. V.

Мартыненко-Макаев Юрий Владимирович – науч. сотрудник.

ул. Сурганова, 13, 220072, Минск.

Yury V. Martynenko-Makaev – Researcher. 

13, Surganov Str., 220072, Minsk.

yrmart@gmail.comКругликА. С.KruhlikA. S.

Круглик Александр Сергеевич – мл. науч. сотрудник.

ул. Сурганова, 13, 220072, Минск.

Aliaksandr S. Kruhlik – Junior researcher.

13, Surganov Str., 220072, Minsk.

a.kruhlik@gmail.comШаркоО. Л.SharkoO. L.

Шарко Ольга Леонидовна - канд. хим. наук, ст. науч. сотрудник.

ул. Сурганова, 13, 220072, Минск.

Olga L. Sharko – Ph. D. (Chemistry), Senior researcher.

13, Surganov Str., 220072, Minsk.

olsharko@gmail.comШманайВ. В.ShmanaiV. V.

Шманай Вадим Владимирович – канд. хим. наук, зав. лаб.

ул. Сурганова, 13, 220072, Минск.

Vadim V. Shmanai – Ph. D. (Chemistry), Head of the Laboratory.

13, Surganov Str., 220072, Minsk.

shmanai@ifoch.bas-net.byИнститут физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси.Institute of Physical Organic Chemistry, National Academy of Sciences of Belarus .201823062018542197203Copyright © Мартыненко-Макаев Ю.В., Круглик А.С., Шарко О.Л., Шманай В.В., 20182018Мартыненко-Макаев Ю.В., Круглик А.С., Шарко О.Л., Шманай В.В.Martynenko-Makaev Y.V., Kruhlik A.S., Sharko O.L., Shmanai V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestichem.belnauka.by/jour/article/view/321

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является нетоксичным, неиммуногенным, гидрофильным, незаряженным и бионеразлагаемым полимером, и его использование в составе терапевтических белковых препаратов вошло в медицинскую практику. Известно, что ПЭГ, соединенный с терапевтическим белком, способствует более длительному нахождению препарата в организме, снижает его иммуногенность и антигенность, повышает растворимость и стабильность в биологических средах, что позволяет оптимизировать фармакокинетические свойства препарата. Одной из целей оптимизации структуры конъюгатов терапевтических белков с ПЭГом является максимальное сохранение биологической активности белка, что может быть достигнуто с помощью контролируемого пегилирования по заданным сайтам белковой молекулы. В настоящей работе представлен метод двухстадийной модификации белков разветвленными полиэтиленгликолями с использованием реакции [3+2] диполярного циклоприсоединения азидов к алкинам. Описан синтез азидного реагента-разветвителя на основе трис(гидроксиметил)аминометана, содержащего три остатка полиэтиленгликоля. Разработана методика двухстадийной модификации модельного белка бычь- его сывороточного альбумина, включающая введение на первой стадии алкиновых групп при помощи N-гидро- ксисукцинимидного эфира алкинокислоты, которые затем вступают в «клик»-реакцию с азидным пегилирующим реагентом-разветвителем. Полученные конъюгаты выделены с помощью гельпроникающей хроматографии. Число введенных модификаций определено при помощи МАЛДИ масс-спектрометрии.

Polyethyleneglycol (PEG) is nontoxic, nonimmunogenic, hydrophilic, chargeless and nonbiodegradable poliymer. Its usage as a part of therapeutics protein drugs is common in medicine practice. It is known that covalent attachment of PEG conduces to prolong blood circulation half-lives, improves drug solubility and stability and reduces immunogenicity. It allows optimizing pharmacodynamic and pharmacokinetic drug properties. The goal of structure optimization of therapeutic proteins conjugates with PEG is to reduce loss of biological activity. It can be reached through controlled site- specific pegylation. We introduce two-step modification of proteins with branched polyethylenglycols via click-chemistry, synthesis of branched PEG azide reagent on the base of tris(hydroxymethyl)aminomethane with three linear PEG polymers. At first, we introduce alkyne groups with NHS-ester of alkyne acid in BSA protein. Then, branched PEG azide reagent reacts with alkyne function via CuAAC. Purification of the conjugates was done via gel-chromotography. Number of modifications was calculated from MALDI mass-spectra.

полиэтиленгликольмодификация белковклик-химияпегилированиетерапевтические белки пролонгированного действияpolyethyleneglycolprotein modificationCuAACpegylationprolonged therapeutic proteinsReferencesNucci, M. L. The therapeutic value of poly(ethylene glycol)-modified proteins / M. L. Nucci, R. Shorr, A. Abuchowski // Adv. Drug Deliv. Rev. – 1991. – Vol. 6, № 2. – P. 133–151. DOI:10.1016/0169-409X(91)90037-DNucci M. L., Shorr R., Abuchowski A. The therapeutic value of poly(ethylene glycol)-modified proteins. Advanced Drug Delivery Reviews, 1991, vol. 6, no. 2, pp. 133–151. DOI: 10.1016/0169-409X(91)90037-DHarris, J. M. Effect of pegylation on pharmaceuticals / J. M. Harris, R. B. Chess // Nat. Rev. Drug Discov. – 2003. – Vol. 2, № 3. – P. 214–221. DOI: 10.1038/nrd1033Harris J. M., Chess R. B. Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nature Reviews Drug Discovery, 2003, vol. 2, no. 3, pp. 214–221. DOI: 10.1038/nrd1033Swierczewska, M. What is the future of PEGylated therapies? / M. Swierczewska, K. C. Lee, S. Lee // Expert Opin. Emerg. Drugs. – 2015. – Vol. 20, № 4. – P. 531–536. DOI: 10.1517/14728214.2015.1113254Swierczewska M., Lee K.C., Lee S. What is the future of PEGylated therapies? Expert Opinion on Emerging Drugs, 2015, vol. 20, no. 4, pp. 531–536. DOI: 10.1517/14728214.2015.1113254PEGylation of Biopharmaceuticals: A Review of Chemistry and Nonclinical Safety Information of Approved Drugs. / P. L. Turecek [et al.] // J. Pharm. Sci. – 2016. – Vol. 105, № 2. – P. 460–75. DOI:10.1016/j.xphs.2015.11.015Turecek P.L., Bossard M.J., Schoetens F., Ivens I.A. PEGylation of Biopharmaceuticals: A Review of Chemistry and Nonclinical Safety Information of Approved Drugs. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2016, vol. 105, no. 2, pp. 460–475. DOI: 10.1016/j.xphs.2015.11.015Jevševar, S. PEGylation of therapeutic proteins / S. Jevševar, M. Kunstelj, V. G. Porekar // Biotechnol. J. – 2010. – Vol. 5, № 1. – P. 113–128. DOI:10.1002/biot.200900218Jevševar S., Kunstelj M., Porekar V. G. PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnology Journal, 2010, vol. 5, no. 1, pp. 113–128. DOI: 10.1002/biot.200900218A branched monomethoxypoly(ethylene glycol) for protein modification. / C. Monfardini [et al.] // Bioconjug. Chem. – Vol. 6, № 1. – P. 62–9. DOI: 10.1021/bc00031a006Monfardini C., Schiavon O., Caliceti P., Morpurgo M., Harris J. M., Veronese, F. M. A branched monomethoxypoly(ethylene glycol) for protein modification. Bioconjugate Chemistry, 1995, vol. 6, no. 1, pp. 62–69. DOI: 10.1021/bc00031a006Therapeutic proteins: a comparison of chemical and biological properties of uricase conjugated to linear or branched poly(ethylene glycol) and poly(N-acryloylmorpholine) / O. Schiavon [et al.] // Il Farmaco. – 2000. – Vol. 55, № 4. – P. 264–269. DOI: 10.1016/s0014-827x(00)00031-8Schiavon O., Caliceti P., Ferruti P., Veronese F. M. Therapeutic proteins: a comparison of chemical and biological properties of uricase conjugated to linear or branched poly(ethylene glycol) and poly(N-acryloylmorpholine). Il Farmaco, 2000, vol. 55, no. 4, pp. 264–269. DOI: 10.1016/s0014-827x(00)00031-8PEG-Ara-C conjugates for controlled release. / O. Schiavon [et al.] // Eur. J. Med. Chem. – 2004. – Vol. 39, № 2. – P. 123-33. DOI:10.1016/j.ejmech.2003.10.005Schiavon O., Pasut G., Moro S., Orsolini P., Guiotto A., Veronese F. M. PEG-Ara-C conjugates for controlled release. European Journal of Medicinal Chemistry, 2004, vol. 39, no. 1, pp. 123–133. DOI: 10.1016/j.ejmech.2003.10.005PEG-metronidazole conjugates: synthesis, in vitro and in vivo properties / C. Bersani [et al.] // Il Farm. – 2005. – Vol. 60, № 9. – P. 783–788. DOI:10.1016/j.farmac.2005.04.015Bersani C., Berna M., Pasut G., Veronese F. M. PEG-metronidazole conjugates: synthesis, in vitro and in vivo properties. Il Farmaco, 2005, vol. 60, no. 9, pp. 783–788. DOI: 10.1016/j.farmac.2005.04.015Comparison of bioactivities of monopegylated rhG-CSF with branched and linear mPEG / X.-Q. Li [et al.] // Process Biochem. – 2007. – Vol. 42, № 12. – P. 1625–1631. DOI: 10.1016/j.procbio.2007.09.005Li X.-Q., Lei J.-D., Su Z.-G., Ma G.-H. Comparison of bioactivities of monopegylated rhG-CSF with branched and linear mPEG. Process Biochemistry, 2007, vol. 42, no. 12, pp. 1625–1631. DOI: 10.1016/j.procbio.2007.09.005Lactoferrin Conjugated with 40-kDa Branched Poly(ethylene Glycol) Has an Improved Circulating Half-Life / Y. Nojima [et al.] // Pharm. Res. – 2009. – Vol. 26, № 9. – P. 2125–2132. DOI: 10.1007/s11095-009-9925-zNojima Y., Suzuki Y., Yoshida K., Abe F., Shiga T., Takeuchi T., Sugiyama A., Shimizu H., Sato A. Lactoferrin Conjugated with 40-kDa Branched Poly(ethylene Glycol) Has an Improved Circulating Half-Life. Pharmaceutical Research, 2009, vol. 26, no. 9, pp. 2125–2132. DOI: 10.1007/s11095-009-9925-zPEGylation of Biopharmaceuticals: A Review of Chemistry and Nonclinical Safety Information of Approved Drugs / P. L. Turecek [et al.] // J. Pharm. Sci. – 2016. – Vol. 105, № 2. – P. 460–475. DOI: 10.1016/j.xphs.2015.11.015Turecek P. L., Bossard M. J., Schoetens F., Ivens I. A. PEGylation of Biopharmaceuticals: A Review of Chemistry and Nonclinical Safety Information of Approved Drugs. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2016, vol. 105, no. 2, pp. 460–475. DOI: 10.1016/j.xphs.2015.11.015Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. / A. Abuchowski [et al.] // J. Biol. Chem. – 1977. – Vol. 252, № 11. – P. 3582-3586.Abuchowski A., McCoy J. R., Palczuk N. C., van Es T., Davis F. F. Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. Journal of Biological Chemistry, 1977, vol. 252, no. 11, pp. 3582–3586.Reduction of immunoreactivity of bovine serum albumin conjugated with polyethylene glycol(PEG) in relation to its esterase activity / A. Matsushima [et al.] // Biochem. Int. – 1992. – Vol. 26, № 3. – P. 485-490.Matsushima A., Sasaki H., Kodera Y., Inada Y. Reduction of immunoreactivity of bovine serum albumin conju- gated with polyethylene glycol(PEG) in relation to its esterase activity. Biochemistry International, 1992, vol. 26, no. 3, pp. 485–490.Yamasaki, N. Novel polyethylene glycol derivatives for modification of proteins / N. Yamasaki, A. Matsuo, H. Isobe // Agric. Biol. Chem. – 1988. – Vol. 52, № 8. – P. 2125–2127. DOI: 10.1271/bbb1961.52.2125Yamasaki N., Matsuo A., Isobe H. Novel polyethylene glycol derivatives for modification of proteins. Agricultural and Biological Chemistry, 1988, vol. 52, no. 8, pp. 2125–2127. DOI: 10.1271/bbb1961.52.2125Veronese, F.M. Branched and Linear Poly(Ethylene Glycol): Influence of the Polymer Structure on Enzymological, Pharmacokinetic, and Immunological Properties of Protein Conjugates / F. M. Veronese, P. Caliceti, O. Schiavon // J. Bioact. Compat. Polym. – 1997. – Vol. 12, № 3. – P. 196–207. DOI: 10.1177/088391159701200303Veronese F. M., Caliceti P., Schiavon O. Branched and Linear Poly(Ethylene Glycol): Influence of the Polymer Structure on Enzymological, Pharmacokinetic, and Immunological Properties of Protein Conjugates. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 1997, vol. 12, no. 3, pp. 196–207. DOI: 10.1177/088391159701200303Veronese, F.M. PEGylation, successful approach to drug delivery / F. M. Veronese, G. Pasut // Drug Discov. Today. – 2005. – Vol. 10, № 21. – P. 1451–1458. DOI:10.1016/S1359-6446(05)03575-0Veronese F. M., Pasut G. PEGylation, successful approach to drug delivery. Drug Discovery Today, 2005, vol. 10, no. 21, pp. 1451–1458. DOI: 10.1016/S1359-6446(05)03575-0Site-specific PEGylation of therapeutic proteins via optimization of both accessible reactive amino acid residues and PEG derivatives. / C. Zhang [et al.] // BioDrugs. – 2012. – Vol. 26, № 4. – P. 209–215. DOI: 10.2165/11633350-000000000-00000Zhang C., Yang X., Yuan Y., Pu J., Liao F. Site-specific PEGylation of therapeutic proteins via optimiza- tion of both accessible reactive amino acid residues and PEG derivatives. BioDrugs, 2012, vol. 26, no. 4, pp. 209–215. DOI: 10.2165/11633350-000000000-00000Neumann, H. Rewiring translation – Genetic code expansion and its applications / H. Neumann // FEBS Lett. – 2012. – Vol. 586, № 15. – P. 2057–2064. DOI: 10.1016/j.febslet.2012.02.002Neumann H. Rewiring translation - Genetic code expansion and its applications. FEBS Letters, 2012, vol. 586, no. 15, pp. 2057–2064. DOI: 10.1016/j.febslet.2012.02.002Hendrickson, T. L. Incorporation of Nonnatural Amino Acids Into Proteins / T. L. Hendrickson, V. de Crécy-Lagard, P. Schimmel // Annu. Rev. Biochem. – 2004. – Vol. 73, № 1. – P. 147-176. DOI:10.1146/annurev.biochem.73.012803.092429Hendrickson T.L., Crécy-Lagard V. de Schimmel P. Incorporation of Nonnatural Amino Acids Into Proteins. Annual Review of Biochemistry, 2004, vol. 73, no. 1, pp. 147–176. DOI: 10.1146/annurev.biochem.73.012803.092429Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol / A. Abuchowski [et al.] // J. Biol. Chem. – 1977. – Vol. 252, № 11. – P. 3578–3581.Abuchowski A., van Es T., Palczuk N. C., Davis F. F. Alteration of immunological properties of bovine se- rum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. Journal of Biological Chemistry, 1977, vol. 252, no. 11, pp. 3578–3581.Roberts, M. J. Chemistry for peptide and protein PEGylation. / M. J. Roberts, M. D. Bentley, J. M. Harris // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2002. – Vol. 54, № 4. – P. 459–476. DOI: 10.1016/s0169-409x(02)00022-4Roberts M. J., Bentley M. D., Harris J. M. Chemistry for peptide and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, vol. 54, pp. 459–476. DOI: 10.1016/s0169-409x(02)00022-4

The authors declare that there are no conflicts of interest present.