vestichИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия химических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Chemical Series1561-83312524-2342The Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1561-8331-2020-56-4-457-464vestich-617Research ArticleБИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯBIOORGANIC CHEMISTRYСтабильность 5'-диметокситритильной защитной группы синтетического олигонуклеотида в условиях полимеразной цепной реакции5'-Dimethoxytrityl protection group of synthetic oligonucleotide stability in polymerase chain reactionЩурВ. В.ShchurV. V.

Щур Вероника Владимировна - младший научный сотрудник.

Ул. Акад. В. Ф. Купревича, 5/2, 220141, Минск

Veronika Vladimirovna Shchur - Junior Researcher.

shchur931@gmail.comЖолнеровичA. И.ZholnerovichA. I.

Жолнерович Андрей Иванович - студент.

Ул. Акад. В. Ф. Купревича, 5/2, 220141, Минск

Andrei Z. Ivanavich - Student.

5/2, Acad. Kuprevich Str., Minsk

a.zhauniarovich@gmail.comБуренковаЮ. П.BurankovaY. P.

Буренкова Юлия Павловна - младший научный сотрудник.

Ул. Акад. В. Ф. Купревича, 5/2, 220141, Минск

Yuliya P. Burankova - Junior Researcher.

5/2, Acad. Kuprevich Str., Minsk

ms.yuliyab@mail.ruЯнцевичА. В.YantsevichA. V.

Янцевич Алексей Викторович - кандидат химических наук, заведующий лабораторией.

Aleksei V. Yantsevich - Ph. D. (Chemistry), Head of the Laboratory.

5/2, Acad. Kuprevich Str., Minsk

al.yantsevich@gmail.comУсановС. А.UsanovS. A.

Усанов Сергей Александрович - член-корреспондент, доктор химических наук, профессор, гл. научный сотрудник.

Ул. Акад. В. Ф. Купревича, 5/2, 220141, Минск

Sergei A. Usanov - Corresponding Member of the National Academy of Sciences of Belarus, D. S. (Chemistry), Professor, Principal Researcher.

5/2, Acad. Kuprevich Str., Minsk

us-anov@iboch.byИнститут биоорганической химии, Национальная академия наук БеларусиInstitute of Bioorganic Chemistry, National Academy of Sciences of Belarus202005122020564457464Copyright © Щур В.В., Жолнерович A.И., Буренкова Ю.П., Янцевич А.В., Усанов С.А., 20202020Щур В.В., Жолнерович A.И., Буренкова Ю.П., Янцевич А.В., Усанов С.А.Shchur V.V., Zholnerovich A.I., Burankova Y.P., Yantsevich A.V., Usanov S.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestichem.belnauka.by/jour/article/view/617

Модификация 5-OH группы нуклеиновых кислот заместителями с различными физико-химическими свойствами имеет принципиальное значение для молекулярной биологии. Интересным представляется исследование симметричного и асимметричного замещения 5'-гидроксила двуцепочечной ДНК (дцДНК) 4,4'-диметок-ситритильной (ДМТ) группой. Симметричное замещение может позволить осуществлять селективное лигирование дцДНК в плазмидный вектор после ее сборки из олигонуклеотидов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) по сравнению с побочными укороченными продуктами сборки. Синтез асимметрично меченной 5'-ДМТ дцДНК при условии наличия специфичной к модификациям 5'-конца экзонуклеазы позволит получать протяженную синтетическую оцДНК, применяемую для сайт-специфичного включения гена в геном с использованием технологии CRISPR/ Cas9. Чтобы провести подобные исследования необходимо выяснить, стабилен ли синтетический 5'-ДМТ олигонуклеотид в условиях ПЦР. B данной работе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ (260 нм) и масс-спектрометрической детекцией мы показали, что 5'-ДМТ-группа стабильна в составе синтетического олигонуклеотида в условиях ПЦР, однако присутствие тиольных соединений может снижать выход 5'-ДМТ-дцДНК. Мы планируем дальнейшее изучение влияния 5'-ДМТ-группы в составе синтетических ДНК на функционирование различных ферментов.

Modification of 5'-OH group of nucleic acids by substituents with various physicochemical properties is important for molecular biology. Investigation of symmetric and asymmetric substitution of 5'-hydroxyl of dsDNA by 4,4'-dimetho-xytrityl (DMT) group seems interesting. Symmetric substitution can allow performing a selective ligation of dsDNA assembled from oligonucleotides by polymerase chain reaction as compared to shortened assembly by-products into a plasmid vector. Synthesis of asymmetrically labeled 5'-DMT dsDNA in case of presence of exonuclease specific to 5'-end modifications will allow obtaining a long synthetic ssDNA used for site-specific gene insertion into a genome by CRISPR/Cas9 technique. To conduct such investigations, it is necessary to know whether synthetic 5'-DMT oligonucleotide is stable under PCR conditions. Here we demonstrated by high performance liquid chromatography with UV (260 nm) and mass-spectrometric detection that 5'-DMT group of synthetic oligonucleotide is stable under PCR conditions but the presence of thiol compounds can decrease a yield of 5'-DMT dsDNA. We plan a further research on influence of 5'-DMT group of synthetic DNA on functionality of various enzymes.

олигонуклеотиды44'-диметокситритильная группаДМТполимеразная цепная реакцияПЦРсинтетический генoligonucleotides44'-dimethoxytrityl groupDMTpolymerase chain reactionPCRsynthetic geneРабота выполнена в рамках задания 2.20 подпрограммы 2 государственной программы научных исследований «Химические технологии и материалы» на 2016-2020 гг., а также отдельного проекта фундаментальных и прикладных научных исследований НАН Беларуси «Разработка и автоматизация эффективных методов получения синтетических генов» на 2018-2019 гг.This work has been performed as a part of project 2.20 of the subprogram 2 of the state program “Chemical technologies and materials” for 2016-2020, and also as a part of separate project of fundamental and applied scientific research of the National Academy of Sciences of Belarus “Development and automation of effective methods of synthetic gene obtaining” for 2018-2019ReferencesVersatile 5'-functionalization of oligonucleotides on solid support: amines, azides, thiols, and thioethers via phosphorus chemistry / G. P. Miller [et al.] // J. Org. Chem. - 2004. - Vol. 69, N 7. - P. 2404-2410. https://doi.org/10.1021/jo035765eMiller G. P., Kool E. T. Versatile 5'-functionalization of oligonucleotides on solid support: amines, azides, thiols, and thioethers via phosphorus chemistry. Journal of Organic Chemistry, 2004, vol. 69, no. 7, pp. 2404-2410. https://doi.org/10.1021/jo035765eEnzymatic synthesis of RNAs capped with nucleotide analogues reveals the molecular basis for substrate selectivity of RNA capping enzyme: impacts on RNA metabolism / M. Issur [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, N 9. - P. e75310. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0075310Issur M., Bougie I., Despins S., Bisaillon M. Enzymatic synthesis of RNAs capped with nucleotide analogues reveals the molecular basis for substrate selectivity of RNA capping enzyme: impacts on RNA metabolism. PLoS One, 2013, vol. 8, iss. 9, pp. e75310. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0075310RNA interference and chemically modified small interfering RNAs / M. Manoharan // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2004. -Vol. 8, N 6. - P. 570-579. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2004.10.007Manoharan M. RNA interference and chemically modified small interfering RNAs. Current Opinion in Chemical Biology, 2004, vol. 8, iss. 6, pp. 570-579. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2004.10.007The synthesis of isopropylidene mRNA cap analogs modified with phosphorothioate moiety and their evaluation as promoters of mRNA translation / M. Warminski [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2013. - Vol. 23, N 13. - P. 37533758. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2013.05.001Warminski M., Kowalska J., Buck J., Zuberek J., Lukaszewicz M., Nicola C., Kuhn A. N., Sahin U., Darzynkiewicz E., Jemielity J. The synthesis of isopropylidene mRNA cap analogs modified with phosphorothioate moiety and their evaluation as promoters of mRNA translation. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, vol. 23, iss. 13, pp. 3753-3758. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2013.05.001Potential therapeutic applications of RNA cap analogs / M. Ziemniak [et al.] // Future Med Chem. - 2013. - Vol. 5, N 10. - P. 1141-1172. https://doi.org/10.4155/fmc.13.96Ziemniak M., Strenkowska M., Kowalska J., Jemielity J. Potential therapeutic applications of RNA cap analogs. Future Medicinal Chemistry, 2013, vol. 5, iss. 10, pp. 1141-1172. https://doi.org/10.4155/fmc.13.96In vitro synthesis of gene-length single-stranded DNA / R. Veneziano [et al.] // Sci. Rep. - 2018. - Vol. 8, N 1. -P. 6548. https://doi.org/10.1038/s41598-018-24677-5Veneziano R., Shepherd T. R., Ratanalert S., Bellou L., Tao C., Bathe M. In vitro synthesis of gene-length single-stranded DNA. Scientific Reports, 2018, vol. 8, iss. 1, pp. 6548. https://doi.org/10.1038/s41598-018-24677-5High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases / F. Chen [et al.] // Nat. Methods. - 2011. - Vol. 8, N 9. - P. 753-755. https://doi.org/10.1038/nmeth.1653Chen F., Pruett-Miller S. M., Huang Y., Gjoka M., Duda K., Taunton J., Collingwood T. N., Frodin M., Davis G. D. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nature Methods, 2011, vol. 8, iss. 9, pp. 753-755. https://doi.org/10.1038/nmeth.1653Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems / L. Cong [et al.] // Science. - 2013. - Vol. 339, N 6121. -P. 819-823. https://doi.org/10.1126/science.1231143Cong L., Ran F. A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P. D., Wu X., Jiang W., Marraffini L. A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas system. Science, 2013, vol. 339, iss. 6121, pp. 819-823. https://doi.org/10.1126/science.1231143Homology-directed repair of DNA nicks via pathways distinct from canonical double-strand break repair / L. Davis [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2014. - Vol. 111, N 10. - P. E924-932. https://doi.org/10.1073/pnas.1400236111Davis L., Maizels N. Homology-directed repair of DNA nicks via pathways distinct from canonical double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2014, vol. 111, iss. 10, pp. E924-932. https://doi.org/10.1073/pnas.1400236111Homologous recombination between single-stranded DNA and chromosomal genes in Saccharomyces cerevisiae / J. R. Simon [et al.] // Mol. Cell. Biol. - 1987. - Vol. 7. N 7. - P. 2329-2334. https://doi.org/10.1128/mcb.7.7.2329Simon J. R., Moore P. D. Homologous recombination between single-stranded DNA and chromosomal genes in Sac-charomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology, 1987, vol. 7, iss. 7, pp. 2329-2334. https://doi.org/10.1128/mcb.7.7.2329Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme / L. K. Wang [et al.] // EMBO J. -2002. - Vol. 21, N 14. - P. 3873-3880. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf397Wang L. K., Lima C. D., Shuman S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal, 2002, vol. 21., iss. 14, pp. 3873-3880. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf397Heat-labile phosphatase simplifies the preparation of dephosphorylated vector DNA / L. M. Hoffman [et al.] // Gene. -1990. - Vol. 88, N . - P. 97-99. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90064-xHoffman L. M., Jendrisak J. Heat-labile phosphatase simplifies the preparation of dephosphorylated vector DNA. Gene, 1990, vol. 88, iss. 1, pp. 97-99. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90064-xСинтетические нуклеиновые кислоты. Получение и перспективы терапевтического применения / Т. С. Орец-кая [и др.]. - М.: МГУ, 2015. - 102 c.OretskayaT. S., Metelev V. G., Romanova E.A., GottikhM. B. Synthetic nucleic acids. Obtaining and perspectives of therapeutic application. Moscow, MSU Publ., 2015. 102 p. (in Russian).Purification of crude DNA oligonucleotides by solid-phase extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography / M. Gilar [et al.] // J. Chromatogr A. - 2000. - Vol. 890, N 1. - P. 167-177. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(00)00521-5Gilar M., Bouvier E. S. P. Purification of crude DNA oligonucleotides by solid-phase extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 2000, vol. 890, iss. 1, pp. 167-177. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(00)00521-5Programmed assembly of long DNA synthons: design, mechanism, and online monitoring / V. V. Shchur [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2019. - Vol. 103, N 21-22. - P. 9103-9117. https://doi.org/10.1007/s00253-019-10099-4Shchur V. V., Burankova Y. P., Shapira M. A., Klevzhits D. V., Usanov S. A., Yantsevich A. V. Programmed assembly of long DNA synthons: design, mechanism, and online monitoring. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, vol. 103, iss. 21-22, pp. 9103-9117. https://doi.org/10.1007/s00253-019-10099-4Characterization of Synthetic Oligonucleotides Using Agilent LC/MS Systems [Electronic Resource] // Agilent Technologies. - Mode of access: https://www.gimitec.com/file/5990-3539EN.pdf. - Date of access: 18.09.2020.Kreutzian T., Waldheim M., Jackson A., Hoppe M., Mokler V., Eidenmueller D., Hill K. Characterization of Synthetic Oligonucleotides Using Agilent LC/MS Systems. Agilent Technologies. 2009. Available at: https://www.gimitec.com/file/5990-3539EN.pdf. (accessed 18 September 2020).Solid-Phase Oligodeoxynucleotide Synthesis: A Two-Step Cycle Using Peroxy Anion Deprotection / A. B. Sierzchala [et al.] // Journal of the American Chemical Society. - 1998. - Vol. 125, N. 44. - P. 13427-13441. https://doi.org/10.1021/ja030376nSierzchala A. B., Dellinger D. J., Betley J. R., Wyrzykiewicz T. K., Yamada C. M., Caruthers M. H. Solid-Phase Oligodeoxynucleotide Synthesis: A Two-Step Cycle Using Peroxy Anion Deprotection. Journal of the American Chemical Society, 1998, vol. 125 , iss. 44, pp. 13427-13441. https://doi.org/10.1021/ja030376n

The authors declare that there are no conflicts of interest present.