Получение и характеристика рекомбинантной глутатионтрансферазы Р1 человека и скрининг новых ингибиторов фермента

Глутатионтрансфераза Р1 человека (GSTP1) играет важную роль во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков и в регуляции апоптотических сигнальных путей. Направленный скрининг новых ингибиторов фермента является актуальной задачей, так как избирательное подавление активности GSTP1 в опухолевых клетках может существенно повысить их чувствительность к химиотерапии. Известные методы получения рекомбинантной GSTP1 с гексагистидиновым тэгом в структуре отличаются сложностью, трудоемкостью и значительными потерями активности фермента. С целью создать простую и эффективную систему бактериальной экспрессии бестэговой GSTP1 с нативной структурой и высокой активностью, в настоящей работе проведено клонирование полноразмерного гена gstp1 в плазмидный вектор pTXB1 с последующей трансформацией клеток E. coli. Оптимизированный уровень экспрессии составил 30–32 мг фермента/л среды. С использованием глутатионсодержащих аффинных мембран из бактериального лизата выделен очищенный фермент (выход 75,7 %, удельная активность 102,6 Ед/мг белка). Гомогенность препарата подтверждена данными гель-электрофореза и масс-спектрометрии. Физико-химические и каталитические свойства рекомбинантной GSTP1 практически совпали с таковыми для нативного фермента из эритроцитов. По результатам скрининга in silico и in vitro выявлены структурные факторы и взаимодействия, определяющие эффективность ингибирования фермента карбо- и N-гетероциклическими лигандами. Установлена предпочтительная ориентация «хороших» ингибиторов в Н-сайте GSTP1. Обнаружены новые ингибиторы фермента: 1,10-фенантролин-5,6-дион, ализариновый красный С и индигокармин с величиной IC₅₀ соответственно 31, 16 и 2,3 мкМ. Найденные соединения представляют интерес для создания новых лидерных структур с потенциальной противоопухолевой активностью.

1. Wu, B. Human cytosolic glutathione transferases: structure, function, and drug discovery / B. Wu, D. Dong // Trends Pharmacol. Sci. – 2012. – Vol. 33, N 12. – P. 656–668. https://doi.org/10.1016/j.tips.2012.09.007

2. Калинина, Е. В. Роль глутатиона, глутатионтрансферазы и глутаредоксина в регуляции редокс-зависимых процессов / Е. В. Калинина, Н. Н. Чернов, М. Д. Новичкова // Успехи биол. хим. – 2014. – Т. 54. – С. 299–348.

3. Townsend, D. M. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance / D. M. Townsend, K. D. Tew // Oncogene. – 2003. – Vol. 22, N 47. – P. 7369–7375. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1206940

4. The ligandin (non-substrate) binding site of human Pi class glutathione transferase is located in the electrophile binding site (H-site) / A. J. Oakley [et al.] // J. Mol. Biol. – 1999. – Vol. 291, N 4. – Р. 913–926. https://doi.org/10.1006/jmbi.1999.3029

5. Mathew, N. Glutathione S-transferase (GST) inhibitors / N. Mathew, M. Kalyanasundaram, K. Balaraman // Expert Opin. Ther. Patents. – 2006. – Vol. 16, N 4. – P. 431–444. https://doi.org/10.1517/13543776.16.4.431

6. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases / N. Allocati [et al.] // Oncogenesis. – 2018. – Vol. 7, N 1. https://doi.org/10.1038/s41389-017-0025-3

7. Mannervik, B. Glutathione Transferase (Human Placenta) / B. Mannervik, C. Guthenberg // Methods Enzymol. – 1981. – Vol. 77. – P. 231–235. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(81)77030-7

8. Awasthi, Y. C. Purification and characterization of a new form of glutathione S-transferase from human erythrocytes / Y. C. Awasthi, S. V. Singh // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1984. – Vol. 125, N 3. – P. 1053–1060. https://doi.org/10.1016/0006-291x(84)91390-1

9. Гилевич, С. Н. Получение высокоактивной глутатион-S-трансферазы Р1-1 из эритроцитов человека с помощью аффинных мембран и свойства очищенного фермента / С. Н. Гилевич, Ю. В. Бречко, К. Ю. Рипинская // Вес. Нац. акад. навук Беларусі. Сер. хім. навук. – 2017. – № 2. – С. 66–79.

10. Chang, M. Expression and purification of hexahistidine-tagged human glutathione S-transferase P1-1 in Escherichia coli / M. Chang, J. L. Bolton, S. Y. Blond // Protein Expr. Purif. – 1999. – Vol. 17, N 3. – P. 443–448. https://doi.org/10.1006/prep.1999.1149

11. Wu, Y. Expression, purification and functional analysis of hexahistidine-tagged human glutathione S-transferase P1-1 and its cysteinyl mutants / Y. Wu, J. Shen, Z. Yin // Protein J. – 2007. – Vol. 26, N 6. – P. 359–370. https://doi.org/10.1007/s10930-006-9043-2

12. High-level bacterial expression of human glutathione transferase P1-1 encoded by semisynthetic DNA / R. H. Kolm [et al.] // Protein Expr. Purif. – 1995. – Vol. 6, N 3. – P. 265–271. https://doi.org/10.1006/prep.1995.1034

13. Battistoni, A. Cytoplasmic and periplasmic production of human placental glutathione transferase in Escherichia coli / A. Battistoni [et al.] // Protein Expr. Purif. – 1995. – Vol. 6, N 5. – Р. 579–587. https://doi.org/10.1006/prep.1995.1076

14. Denisova, A. S. Synthesis of bifunctional ligands based on azaheterocycles and fragments of 12-crown-4 / A. S. Denisova [et al.] // Russ. J. Org. Chem. – 2005. – Vol. 41, N 11. – P. 1690–1693. https://doi.org/10.1007/s11178-006-0020-1

15. Kleineweischede, A. Synthesis of amino- and bis(bromomethyl)-substituted bi- and tetradentate N-heteroaromatic ligands: building blocks for pyrazino-functionalized fullerene dyads / A. Kleineweischede, J. Mattay // Eur. J. Org. Chem. – 2006. – Vol. 2006, N 4. – P. 947–957. https://doi.org/10.1002/ejoc.200500548

16. On the synthesis of pyrazino[2,3-b]phenazine and 1H-imidazo[4,5-b]phenazine derivatives / A.M. Amer [et al.] // Monatsh. Chem. – 1999. – Vol. 130, N 10. – Р. 1217–1225. https://doi.org/10.1007/PL00010183

17. Detection of circulating cytokeratin-positive cells in the blood of breast cancer patients using immunomagnetic enrichment and digital microscopy / T. E. Witzig [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2002. – Vol. 8, N 5. – P. 1085–1091.

18. Homo sapiens full open reading frame cDNA clone RZPDo834C083D for gene GSTP1, glutathione S-transferase pi; complete cds; without stopcodon [Electronic resource] // The National Center for Biotechnology Information. – 2016. – Mode of access: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/47496668. – Date of access: 19.04.2017.

19. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1977. – Vol. 74, N 12. – P. 5463–5467. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463

20. Design, expression, and purification of a Flaviviridae polymerase using a high-throughput approach to facilitate crystal structure determination / K. H. Choi [et al.] // Protein Sci. – 2004. – Vol. 13, N 10. – P. 2585–2692. https://doi.org/10.1110/ps.04872204

21. Gateway recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames ORFeomes / A. J. Walhout [et al.] // Methods Enzymol. – 2000. – Vol. 328 – P. 575–592. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(00)28419-x

22. Engebrecht, J. Minipreps of plasmid DNA / J. Engebrecht, R. Brent, M. A. Kaderbhai // Current protocols of molecular biology / eds. F. M. Ausubel [et al.]. – Wiley, 2003. – Ch. 1.6. – P. 1.6.1.–1.6.2. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb0106s15

23. Motulsky, H. Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting / H. Motulsky, A. Christopoulos. Oxford: Oxford University Press, 2004. – 351 p.

24. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite / S. Forli [et al.] // Nat. Protocols. – 2016. – V. 11, N 5. – P.905–919. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.051

25. 6GSS. Human glutathione s-transferase p1-1, complex with glutathione [Electronic resource] // RCSB Protein Data Bank. – Mode of access: https://www.rcsb.org/structure/6gss. – Date of access: 14.10.2016.

26. PubChem Compound Database [Electronic resource]. – Mode of access: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. – Date of access: 28.01.2020.

27. Pedretti, A. VEGA: a versatile program to convert, handle and visualize molecular structure on Windows-based PCs. / A. Pedretti, L. Villa, G. Vistoli // J. Mol. Graph. Model. – 2002. – Vol. 21, N 1. – Р.47–49. https://doi.org/10.1016/s1093-3263(02)00123-7

28. UCSF Chimera – a visualization system for exploratory research and analysis / E. F. Pettersen [et al.] // J. Comput. Chem. – 2004. – Vol. 25, N 13. – Р. 1605–1612. https://doi.org/10.1002/jcc.20084

29. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, N 5259. – P. 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0

30. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72, N 1–2. – P. 248–254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3

31. Shotgun analysis of membrane proteomes using a novel combinative strategy of solution-based sample preparation coupled with liquid chromatography–tandem mass spectrometry / Y. Lin [et al.] // J. Chromatogr. B. – 2012. – Vol. 901, N 1. Р. 18–24. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2012.05.035

32. GSTP1 mRNA expression in human circulating blood leukocytes is associated with GSTP1 genetic polymorphism / E. Reszka [et al.] // Clin. Biochem. – 2011. – Vol. 44, N 13. Р. 1153–1155. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2011.05.024

33. pTXB1 vector [Electronic resource] // BioLabs. – Mode of access: https://international.neb.com/products/n6707-ptxb1-vector#Protocols, Manuals & Usage. – Date of access: 28.01.2018.

34. Glutathione S-transferase P1: gene sequence variation and functional genomic studies / A. M. Moyer [et al.] // Cancer Res. – 2008. – Vol. 68, N 12. – P. 4791–4801. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-07-6724

35. Structure and function of the xenobiotic substrate-binding site and location of a potential non-substrate-binding site in a class π glutathione S-transferase / X. Ji [et al.] // Biochemistry – 1997. – Vol. 36, N 32. – Р. 9690–9702. https://doi.org/10.1021/bi970805s.

36. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings / C. A. Lipinski [et al.] // Adv. Drug Deliv. Rev. – 1997. – Vol. 23, N 1–3. – Р. 3–25. https://doi.org/10.1016/s0169-409x(00)00129-0

37. Molecular properties that influence the oral bioavailability of drug candidates / D. F. Veber [et al.] // J. Med. Chem. – 2002. – Vol. 45, N 12. – Р. 2615–2623. https://doi.org/10.1021/jm020017n

38. Structural requirements for the flavonoid-mediated modulation of glutathione S-transferase P1-1 and GS-X pump activity in MCF7 breast cancer cells / J. J. van Zanden [et al.] // Biochem. Pharmacol. – 2004. – Vol. 67, N 8. – Р. 1607–1617. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2003.12.032

39. FDA-approved drugs and other compounds tested as inhibitors of human glutathione transferase P1-1 / Y. Musdal [et al.] // Chem. Biol. Interact. – 2013. – Vol. 205, N 1 – P. 53–62. https://doi.org/10.1016/j.cbi.2013.06.003

40. Zhang, X. Fluorometric method for the microdetermination of protein using indigo carmine / X. Zhang, F. Zhao, K. Li // Microchem. J. – 2001. – Vol. 68, N 1. – P. 53–59. https://doi.org/10.1016/S0026-265X(00)00177-6