Комбинированные системы полимеразной цепной реакции и иммуноанализа с времяразрешенной флуориметрией или мембранной иммунохроматографией для количественного определения ДНК бактерий Salmonella enterica

Разработаны и исследованы четыре модельные биоаналитические системы, специфичные к бактериям Salmonella enterica, в которых в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) продуцировался содержащий остатки биотина и флуоресцеина ампликон ДНК. Это позволило иммобилизовать ампликон в функционализиро- ванной твердой фазе и биоспецифически пометить хелатом европия в микропланшетах или золотыми наночастицами на хроматографической мембране. Количественная детекция модифицированной ДНК осуществлялась в системах иммуноанализа с времяразрешенной флуоресценцией Eu³⁺ (лантанидный иммунофлуоресцентный анализ, ЛИФМА, DELFIA) или с фотометрией окрашенной зоны на хроматографической полоске (ИХА). Разработаны и исследованы три пары праймеров для получения выбранных фрагментов гена invA, присутствующего в геномах всех патогенных сальмонелл. Установлена их пригодность для тест-систем. В микропланшетной системе ЛИФМА диапазон определяемых концентраций полученного ампликона ДНК составил 0,01–10,0 нМ, а предел обнаружения оказался равным 2 пМ. Предел визуальной детекции ампликонов ДНК в ИХА составил 0,05 нМ. Показана возможность проведения тестирования ампликонов без дополнительного выделения ДНК в чистом виде из реакционной смеси. Установлена высокая специфичность разработанных биоаналитических систем для детекции Salmonella enterica различных серотипов.

1. A comparison of standard cultural methods for the detection of foodborne Salmonella / J. Y. D’Aoust [et al.] // Int. J. Food Microbiol. – 1992. – Vol. 16, № 1. – P. 41–50. https://doi.org/10.1016/0168-1605(92)90124-l

2. Соколов, Д. М. Ускоренные методы выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах и сырье. / Д. М. Соколов, М. С. Соколова // Вопр. питания. – 2013. – № 1. – С. 33–40.

3. Choi, D. Sandwich capture ELISA by a murine monoclonal antibody against a genus-specific LPS epitope for the detection of different common serotypes of Salmonellas / D. Choi, R. S. Tsang, M. H. Ng // J. Appl. Bacteriol. – 1992. – Vol. 72, № 2. – P. 134–138. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.1992.tb01814.x

4. Monoclonal antibody-based cross-reactive sandwich ELISA for the detection of Salmonella spp. in milk samples / X. Wu [et al.] // Anal. Methods. – 2015. – Vol. 7, № 21. – P. 9047–9053. https://doi.org/10.1039/C5AY01923K

5. Gold nanoparticle-based strip sensor for multiple detection of twelve Salmonella strains with a genus-specific lipopolysaccharide antibody / W. Wang [et al.] // Sci. China Mater. – 2016. – Vol. 59, № 8. – P. 665–674. https://doi.org/10.1007/s40843-016-5077-0

6. A review of methods for the detection of pathogenic microorganisms / P. Rajapaksha [et al.] // Analyst. – 2019. – Vol. 144, № 2. – P. 396–411. https://doi.org/10.1039/c8an01488d

7. An enzyme-linked immunosorbent assay to detect PCR products of the rfbS gene from serogroup D Salmonellae: a rapid screening prototype/ J. M. Luk [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1997. – Vol. 35, № 3. – P. 714–718. https://doi.org/10.1128/jcm.35.3.714-718.1997

8. Qualitative PCR-ELISA protocol for the detection and typing of viral genomes / M. Musiani [et al.] // Nat. Protoc. – 2007. – Vol. 2, № 10. – P. 2502–2510. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.311

9. Development of an isothermal amplification-based assay for the rapid visual detection of Salmonella bacteria / H.-B. Liu [et al.] // J. Dairy Sci. – 2017. – Vol. 100, № 9. – P. 7016–7025. https://doi.org/10.3168/jds.2017-12566

10. Sensitive and rapid visual detection of Salmonella Typhimurium in milk based on recombinase polymerase amplification with lateral flow dipsticks / J. Hu [et al.] // J. Microbiol. Methods. – 2019. – Vol. 158. – P. 25–32. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019.01.018

11. Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays / I. Hemmilä [et al.] // Anal. Biochem. – 1984. – Vol. 137, № 2. – P. 335–343. https://doi.org/10.1016/0003-2697(84)90095-2

12. Гарбуз, О. С. Лантанидный иммунофлуориметрический анализ: научные основы и технические принципы / О. С. Гарбуз, О. В. Свиридов // ARSmedica. – 2011. – № 13. – С. 51–61.

13. Функционализированные металлохелаты на основе диэтилентриаминтетрауксусной кислоты для химической модификации белков и малых биомолекул / О. С. Куприенко [и др.] // Биоорг. химия. – 2015. – Т. 41, № 6. – С. 675–685. https://doi.org/10.7868/S013234231506007X

14. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions / G. Frens // Nat. Phys. Sci. – 1973. – Vol. 241, № 105. – P. 20–22. https://doi.org/10.1038/physci241020a0

15. Lateral flow immunoassay for rapid qualitative and quantitative control of the veterinary drug bacitracin in milk / N. A. Byzova [et al.] // Microchem. J. – 2020. – Vol. 156. – Article 104884. https://doi.org/10.1016/j.microc.2020.104884

16. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques / G. T. Hermanson. – Elsevier, 1996. – 814 p. https://doi.org/10.1016/0890-8508(92)90002-f

17. Galán, J. E. Cloning and molecular characterization of genes whose products allow Salmonella Typhimurium to penetrate tissue culture cells / J. E. Galán, R. Curtiss // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1989. – Vol. 86, № 16. – P. 6383–6387. https://doi.org/10.1073/pnas.86.16.6383

18. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella Typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella / K. Rahn [et al.] // Mol. Cell. Probes. – 1992. – Vol. 6, № 4. – P. 271–279. https://doi.org/10.1016/0890-8508(92)90002-f

19. Nucleic acid lateral flow assay with recombinase polymerase amplification: solutions for high-sensitive detection of RNA virus // A. V. Ivanov [et al.] // Talanta. – 2020. – Vol. 210. – Article 120616. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.120616

20. Moon, Y.-J. A review of isothermal amplification methods and food-origin inhibitors against detecting food-borne pathogens / Y.-J. Moon, S.-Y. Lee, S.-W. Oh // Foods. – 2022. – Vol. 11, № 3. – P. 322–337. https://doi.org/10.3390/foods11030322

21. An оverview for the nanoparticles-based quantitative lateral flow assay // Z. Wang [et al.] // Small methods. – 2022. – Vol. 6, № 1. – Article 2101143. https://doi.org/10.1002/smtd.202101143