Гармонизация кодонов как способ увеличения уровня экспрессии функционально-активного CYP17A1 человека

CYP17A1 является ключевым ферментом в биосинтезе глюкокортикоидов и андрогенов, а дисфункция данного фермента сопровождается тяжелыми нарушениями в организме, в том числе гормон-зависимыми злокачественными новообразованиями (рак предстательной железы, рак молочной железы). Впервые проведена гармонизация нуклеотидной последовательности гена СYP17A1 человека и осуществлена оптимизация методики его выделения и очистки из бактериальных клеток различных штаммов. Установлено, что гармонизация кодонов гена, кодирующего СYP17A1 человека, позволяет увеличить уровень экспрессии целевого белка на 28 %. Проведенный анализ гармонизации кодонов позволил выявить, что редкими кодонами представлены только определенные аминокислоты (A, C, D, G, I, V, Y), также редкие кодоны встречаются в аминокислотных остатках активного центра белка. В ходе исследования доказано, что гармонизированный белок взаимодействует с природным субстратом СYP17A1 – прогестероном аналогично оптимизированному белку и обладает функциональной активностью. Полученные результаты дают основание считать, что гармонизация кодонов для СYP17A1 человека является методом, способным оптимизировать получение препаративных количеств терапевтически значимого фермента c сохранением его каталитической активности.

1. Non-steroidal CYP17A1 Inhibitors: Discovery and Assessment / T. Wrobel, F. S. Jоrgensen, A. V. Pandey [et al.] // Journal of Medicinal Chemistry. – 2023. – Vol. 66. – P. 6542–6566. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00442

2. Tight binding of cytochrome b5 to cytochrome P450 17A1 is a critical feature of stimulation of C21 steroid lyase activity and androgen synthesis / D. Kim, V. Kim, K. D. McCarty, F. P. Guengerich // Journal of Biological Chemistry. – 2021. – Vol. 296. – Art. 100571. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100571

3. Heterologous Expression of Human Cytochrome P450 (CYP) in Escherichia coli: N-Terminal Modification, Expression, Isolation, Purification, and Reconstitution / T. Shang, C. M. Fang, C. E. Ong, Y. Pan // Biotech (Basel (Switzerland)). – 2023. – Vol. 12, № 1. – Art. 17. https://doi.org/10.3390/biotech12010017

4. Codon Harmonization: going beyond the speed limit for protein expression / C. Mignon, N. Mariano, G. Stadthagen [et al.] // FEBS Letters. – 2018. – Vol. 592, № 9. – P. 1554–1564. https://doi.org/10.1002/1873-3468.13046

5. Angov, E. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding / E. Angov, P. Legler, R. M. Mease // Methods in molecular biology. – 2011. – Vol. 75. – P. 1–13. https://doi.org/10.1007/978-161737-967-3_1

6. Codon Harmonizer. – URL: http://biocatalysis.uni-graz.at/sites/codonharmonizer.html (date of access: 17.12.2022).

7. Improving heterologous membrane protein production in Escherichia coli by combining transcriptional tuning and codon usage algorithms / N. J. Claassens, M. F. Siliakus, S. K. Spaans [et al.] // PLOS One. – 2017. – Vol. 12, № 9. – Art. e0184355. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0184355

8. Exploring Codon Adjustment Strategies towards Escherichia coli-Based Production of Viral Proteins Encoded by HTH1, a Novel Prophage of the Marine Bacterium Hypnocyclicus / H. Arsin, A. Jasilionis, H. Dahle [et al.] // Viruses. – 2021. – Vol. 13, № 7. – Art. 1215. https://doi.org/10.3390/v13071215

9. Codon harmonization reduces amino acid misincorporation in bacterially expressed P. falciparum proteins and impro- ves their immunogenicity / N. Pundeб J. Kooken, D. Leary [et al.] // AMB Express. – 2019. – Vol. 9, № 1. – Art. 167. https://doi.org/10.1186/s13568-019-0890-6

10. Codon Harmonization of a Kir3.1-KirBac1.3 Chimera for Structural Study Optimization / E. van Aalst, M. Yekefallah, A. K. Mehta [et al.] // Biomolecules. – 2020. – Vol. 10, № 3. – Art. 430. https://doi.org/10.3390/biom10030430

11. Harmonization of the Genetic Code Effectively Enhances the Recombinant Production of the Major Birch Pollen Allergen Bet v 1 / C. Asam, A. Roulias, M. A. Parigiani [et al.] // International Archives of Allergy and Immunology. – 2018. – Vol. 177, № 2. – P. 116–122. https://doi.org/10.1159/000489707

12. Van Aalst, E. Cholesterol Is a Dose-Dependent Positive Allosteric Modulator of CCR3 Ligand Affinity and G Protein Coupling / E. van Aalst, B. J. Wylie // Frontiers in Molecular Biosciences. – 2021. – Vol. 8. – Art. 724603. https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.724603

13. Microsomal P450 2C3 is expressed as a soluble dimer in Escherichia coli following modification of its N-terminus / C. von Wachenfeldt, T. H. Richardson, J. Cosme, E. F. Johnson // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 1997. – Vol. 339, № 1. – P. 107–114. https://doi.org/10.1006/abbi.1996.9859

14. Hoover, D. M. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis / D. M. Hoover, J. Lubkowski // Nucleic Acids Research. – 2002. – Vol. 30, № 10. – P. 1–7. https://doi.org/10.1093/nar/30.10.e43

15. DNAWorks (v3.2.4). – URL: https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/ (date of access: 28.03.2022).

16. Yantsevich, A. V. Oligonucleotide Preparation Approach for Assembly of DNA Synthons / A. V. Yantsevich, V. V. Shchur, S. A. Usanov // SLAS Technology. – 2019. – Vol. 24, № 6. – P. 556–568. https://doi.org/10.1177/2472630319850534

17. Modified bile acids and androstanes–novel promising inhibitors of human cytochrome P450 17A1 / Y. Dzichenka, M. Shapira, A. Yantsevich [et al.] // The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. – 2021. – Vol. 205. – Art. 105777. https://doi.org/ 10.1016/j.jsbmb.2020.105777

18. Important amino acid residues involved in folding and binding of protein-protein complexes / A. Kulandaisamy, V. Lathi, K. ViswaPoorani [et al.] // International Journal of Biological Macromolecules. – 2017. – Vol. 94. – P. 438–444. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2016.10.045

19. Комар, А. А. Распределение синонимических кодонов в мРНК определяет путь котрансляционного сворачивания белка в клетке / А. А. Комар // Молекулярная биология. – 2019. – Т. 53, № 6. – С. 883–898. https://doi.org/10.1134/ s0026898419060090