ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОАКТИВНОЙ ГЛУТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗЫ Р1-1 ИЗ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ АФФИННЫХ МЕМБРАН И СВОЙСТВА ОЧИЩЕННОГО ФЕРМЕНТА

Глутатион-S-трансфераза Р1-1 (GSTP1-1) человека является диагностически важным ферментом, гиперэкспрессия которого в опухолях и лимфомах приводит к формированию множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Небольшие количества фермента можно выделить из эритроцитов, однако известные методы очистки не позволяют получить препараты с высокой удельной активностью и хорошим выходом. С целью разработки более эффективной процедуры очистки эритроцитарной GSTP1-1 в настоящей работе впервые получены и охарактеризованы глутатионсодержащие аффинные мембраны на основе химически модифицированной целлюлозной бумаги. Мембраны успешно использованы для очистки фермента вместо традиционных агарозно-гелевых адсорбентов. Разработан новый метод выделения и очистки GSTP1-1 из гемолизата эритроцитов, включающий предварительное удаление гемоглобина на анионообменнике и аффинную хроматографию фермента на картридже с глутатионсодержащими мембранами. По эффективности (выход фермента 76,5 %, степень очистки 23589 раз, удельная активность 104,5 Ед/мг белка) предложенный метод значительно превосходит ранее опубликованные. Гомогенность полученного препарата, по данным гель-электрофореза и масс-спектрометрии, составляет не менее 95%. Найдены стационарные кинетические параметры очищенной GSTP1-1 в реакции конъюгации глутатиона (GSH) и 1-хлор-2,4- динитробензола (CDNB) при рН 6,5 и 25 °С: для GSH K_m = 0,19 мМ, k_cat = 47,8 с–1; для CDNB K_m = 0,68 мМ, k_cat = 54,3 с^–1. Результаты работы представляют интерес для скрининга новых ингибиторов фермента с противоопухолевой активностью. Полученные аффинные мембраны могут быть использованы при выделении нативных и рекомбинантных глутатион-S-трансфераз (GST) из различных источников, а также гибридных белков с GST-доменом. 

1. Hayes, J. D. Glutathione transferases / J. D. Hayes, J. U. Flanagan, I. R. Jowsey // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 2005. – Vol. 45. – P. 51–88.

2. Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death / E. Laborde // Cell Death Differ. – 2010. – Vol. 17, № 9. – P. 1373–1380.

3. Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective / A. Oakley // Drug Metab. Rev. – 2011. – Vol. 43, №2. – P. 138–151.

4. Townsend, D. M. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance / D. M. Townsend, K. D. Tew // Oncogene. – 2003. – Vol. 22, № 47. – P. 7369–7375.

5. Erythrocyte glutathione transferase: a novel biomarker to check environmental pollution hazardous for humans /

6. R. Fabrini [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2012. – Vol. 426, № 1. – P. 71–75.

7. Dissociation of a new glutathione S-transferase activity in human erythrocytes / K. R. Schröder [et al.] // Biochem. Pharmacol. – 1992. – Vol. 43, № 8. – P. 1671–1674.

8. The human glutathione S-transferases. Studies on the kinetic, stability and inhibition characteristics of the erythrocyte enzyme / P. A. Hirrell [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. – 1987. – Vol. 913, № 1. – P. 92–96.

9. Awasthi, Y. C. Purification and characterization of a new form of glutathione S-transferase from human erythrocytes / Y. C. Awasthi, S. V. Singh // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1984. – Vol. 125, № 3. – P. 1053–1060.

10. Howie, A. F. Purification of acidic glutathione S-transferases from human lung, placenta and erythrocyte and the development of a specific radioimmunoassay for their measurement / A. F. Howie, J. D. Hayes, G. J. Beckett // Clin. Chim. Acta. – 1988. – Vol. 177, № 1. – P. 65–76.

11. Purification and biochemical characterization of glutathione S-transferase from Down syndrome and normal children erythrocytes: a comparative study / R. R. Hamed [et al.] // Res. Dev. Disabil. – 2011. – Vol. 32, № 5. – P.1470–1482.

12. Marcus, C. J. Glutathione transferase from human erythrocytes. Nonidentity with the enzymes from liver / C. J. Marcus, W. H. Habig, W. B. Jakoby // Arch. Biochem. Biophys. – 1978. – Vol. 188, № 2. – P. 287–293.

13. Electron paramagnetic resonance identification of a highly reactive thiol group in the proximity of the catalytic site of human placenta glutathione transferase / A. Desideri [et al.] // J. Biol. Chem. – 1991. – Vol. 266, № 4. – P. 2063–2066.

14. Vander Jagt, D. L. Purification and bilirubin binding properties of glutathione S-transferase from human placenta / D. L. Vander Jagt, S. P. Wilson, J. E. Heidrich // FEBS Lett. – 1981. – Vol. 136, № 2. – P. 319–321.

15. Cytoplasmic and periplasmic production of human placental glutathione transferase in Escherichia coli / A. Battistoni [et al.] // Protein Expr. Purif. – 1995. – Vol. 6, № 5. – P. 579–587.

16. High-level bacterial expression of human glutathione transferase P1-1 encoded by semisynthetic DNA // R. H. Kolm [et al.] // Protein Expr. Purif. – 1995. – Vol. 6, № 3. – P. 265–271.

17. Zou, H. Affinity membrane chromatography for the analysis and purification of proteins / H. Zou, Q. Luo, D. Zhou // J. Biochem. Biophys. Methods. – 2001. – Vol. 49, № 1–3. – P. 199–240.

18. Гилевич, С. Н. Аффинные мембраны на основе химически модифицированной целлюлозы для избирательной твердофазной экстракции белков / С. Н. Гилевич, Е. Ю. Завизион // Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии: Нац. акад. наук Беларуси, Ин-т химии новых материалов; науч. ред. В. Е. Агабеков, Е. В. Королева, К. Н. Гусак. – Минск, 2011. – С. 305–319.

19. Гилевич, С. Н. Получение и гемоглобинсвязывающие свойства металлоаффинных мембран на основе химически модифицированной хроматографической бумаги / С. Н. Гилевич, Е. Ю. Завизион // Химия, структура и функция биомолекул: материалы IV Междунар. конф., Минск, 17–19 окт. 2012 г. / Институт биоорганической химии НАН Беларуси; редкол.: С. А. Усанов [и др. ]. – Минск, 2012. – С. 46–47.

20. Forde, G. M. Preparation, analysis and use of an affinity adsorbent for the purification of GST fusion protein / G. M. Forde // Methods Mol. Biol. – 2008. – Vol. 421. – P. 125–136.

21. Burton, S. C. High-density ligand attachment to brominated allyl matrices and application to mixed mode chromatography of chymosin / S. C. Burton, D. R. K. Harding // J. Chromatogr. A. – 1997. – Vol. 775, № 1–2. – P. 39–50.

22. Preparation of the immobilized metal affinity membrane with high amount of metal ions and protein adsorption efficiencies / Y. M. Ke [et al.] // Process Biochem. – 2010. – Vol. 45, № 4. – P. 500–506.

23. Scoble, J. A. Assay for determining the number of reactive groups on gels used in affinity chromatography and its application to the optimisation of the epichlorohydrin and divinylsulfone activation reactions / J. A. Scoble, R. K. Scopes // J. Chromatogr. A. – 1996. – Vol. 752, № 1–2. – P. 67–76.

24. Friedman, M. Applications of the ninhydrin reaction for analysis of amino acids, peptides, and proteins to agricultural and biomedical sciences / M. Friedman // J. Agric. Food Chem. – 2004. – Vol. 52, № 3. – P. 385–406.

25. The Molecular Mechanism of Autoxidation for Human Oxyhemoglobin / M. Tsuruga [et al.] // J. Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273, № 15. – P. 8607–8615.

26. Habig, W. H. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation / W. H. Habig, M. J. Pabst, W. B. Jakoby // J. Biol. Chem. – 1974. – Vol. 249, № 22. – P. 7130–7139.

27. Bisswanger H. Practical Enzymology / H. Bisswanger – 2nd Ed. – Weinheim: Wiley-Blackwell, 2011. – 378 p.

28. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 5259. – P. 680–685.

29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72, № 1–2. – P. 248–254.

30. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes / J. Credou [et al.] // J. Mater. Chem. B. – 2013. – Vol. 1, № 26. – P. 3277–3286.

31. Catalytically active monomer of glutathione S-transferase pi and key residues involved in the electrostatic interaction between subunits / Y. C. Huang [et al.] // J. Biol. Chem. – 2008. – Vol. 283, № 47. – P. 32880–32888.

32. Inactivation of human salivary glutathione transferase P1-1 by hypothiocyanite: a post-translational control system in search of a role / R. Fabrini [et al.] // PLoS One. – 2014. – Vol. 9, № 11. – e112797.

33. Monomer-dimer equilibrium in glutathione transferases: a critical re-examination / R. Fabrini [et al.] // Biochemistry. – 2009. – Vol. 48, № 43. – P. 10473–10482.

34. Study of chromatographic parameters for glutathione S-transferases on an high-performance liquid chromatography affinity stationary phase / J. B. Wheatley [et al.] // J. Chromatogr. A. – 1994. – Vol. 676, № 1. – P. 81–90.

35. Effect of linker for immobilization of glutathione on BSA-assembled controlled pore glass beads / L.-H. Chen [et al.] // Bull. Korean Chem. Soc. – 2004. – Vol. 25, № 9. – P. 1366–1370.

36. Mannervik, B. Glutathione Transferase (Human Placenta) / B. Mannervik, C. Guthenberg // Meth. Enzymol. – 1981. – Vol. 77. – P. 231–235.

37. Thumser, A. E. Kinetic mechanism of human erythrocyte acidic isoenzyme ρ / A. E. Thumser, K. M. Ivanetich // Biochim. Biophys. Acta. – 1993. – Vol. 1203, № 1. – P. 115–120.

38. Studies on the variability of glutathione S-transferase from human erytrocytes / R. C. Strange [et al.] // Clin. Chim. Acta. – 1982. – Vol. 120, № 2. – P. 251–260.

39. Forman, H. J. Glutathione: overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis // H. J. Forman, H. Zhang, A. Rinna // Mol. Aspects Med. – 2009. – Vol. 30, № 1–2. – P. 1–12.

40. Purification of glutathione S-transferase pi from erythrocytes and evaluation of the inhibitory effect of hypericin / S. Turk [et al.] // Protein J. – 2015. – Vol. 34, № 6. – P. 434–443.