Лиганд-связывающие характеристики CYP51 Mycobacterium tuberculosis в отношении стероидных соединений из морских организмов

Стероид-14α-деметилазы CYP51 – представители крупного суперсемейства ферментов цитохромов Р450, обнаруженные во всех царствах живых организмов и катализирующие реакцию 14α-деметилирования ряда природных стероидов, включая ланостерин, обтузифолиол и 24,25-дигидроланостерин. CYP51 являются важными компонентами цепи биосинтеза стероидов у эукариот и по этой причине представляют одну из основных мишеней противогрибковой терапии. Ген, гомологичный стероид-14α-деметилазе CYP51, также обнаружен в геноме Mycobacterium tuberculosis. При этом у M. tuberculosis отсутствует путь de novo биосинтеза стероидов. Консервативность CYP51 среди представителей рода Mycobacterium и колокализация в геноме с 3Fe-4S ферредоксином Rv0763c, который поддерживает его каталитическую активность in vitro, могут косвенно указывать на участие CYP51 в важном для микобактерий биохимическом процессе. С целью установления специфичности активного центра MTCYP51 в отношении различных соединений изопреноидной природы нами получен высокоочищенный белковый препарат MTCYP51 и с помощью методов спектрофотометрического титрования и поверхностного плазмонного резонанса проведены исследования взаимодействия MTCYP51 со стероидами из морских организмов, полученными в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук. Исследованные соединения представляют собой широкий набор эволюционно древних изопреноидов. Результаты показали, что MTCYP51 способен связывать в активном центре разнообразные по структуре производные стероидов. Проведенные исследования позволяют предположить биологическую роль MTCYP51 для патогенных микобактерий, заключающуюся в связывании и возможном метаболизме экзогенных биорегуляторных изопреноидов в условиях in vivo.

1. Global Tuberculosis Report, 2022 / World Health Organization. – Geneva: World Health organization, 2022. – 68 p.

2. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence / S. T. Cole [et al.] // Nature. – 1998. – Vol. 393, № 6685. – P. 537–544. https://doi.org/10.1038/31159

3. CYP51-like gene of Mycobacterium tuberculosis actually encodes a P450 similar to eukaryotic CYP51 / Y. Aoyama [et al.] // J. Biochem. – 1998. – Vol. 124, № 4. – P. 694–696. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022167

4. Characterization and catalytic properties of the sterol 14alpha-demethylase from Mycobacterium tuberculosis / A. Bellamine [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – Vol. 96, № 16. – P. 8937–8942. https://doi.org/10.1073/pnas.96.16.8937

5. Strushkevich, N. Structural basis of human CYP51 inhibition by antifungal azoles / N. Strushkevich, S.A. Usanov, H.-W. Park // J. Mol. Biol. – 2010. – Vol. 397, № 4. – P. 1067–1078. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2010.01.075

6. Lamb, D. C. The first virally encoded cytochrome p450 / D.C. Lamb [et al.] // J. Virol. – 2009. – Vol. 83, № 16. – P. 8266–8269. https://doi.org/10.1128/JVI.00289-09

7. Comprehensive essentiality analysis of the Mycobacterium tuberculosis genome via saturating transposon mutagenesis / M. A. DeJesus [et al.] // mBio. – 2017. – Vol. 8, № 1. – P. 1–17. https://doi.org/10.1128/mBio.02133-16

8. Transcriptional adaptation of drug-tolerant Mycobacterium tuberculosis in mice [Electronic Resource] / E. A. Wynn [et al.] // bioRxiv [Preprint]. – 2023, March 08. – Mode of access: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.03.06.531356v2. https://doi.org/10.1101/2023.03.06.531356

9. Structural insights into 3Fe–4S ferredoxins diversity in M. tuberculosis highlighted by a first redox complex with P450 / A. Gilep [et al.] // Front. Mol. Biosci. – 2023. – Vol. 9. – P. 1–15. https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.1100032

10. X-ray structure of 4, 4′-dihydroxybenzophenone mimicking sterol substrate in the active site of sterol 14α-demethylase (CYP51) / A. N. Eddine [et al.] // J. Biol. Chem. – 2008. – Vol. 283, № 22. – P. 15152–15159. https://doi.org/10.1074/jbc.M801145200

11. Estriol bound and ligand-free structures of sterol 14alpha-demethylase / L. M. Podust [et al.] // Structure. – 2004. – Vol. 12, № 11. – P. 1937–1945. https://doi.org/10.1016/j.str.2004.08.009

12. Human lanosterol 14-alpha demethylase (CYP51A1) Is a putative target for natural flavonoid luteolin 7, 3′-disulfate / L. Kaluzhskiy [et al.] // Molecules. – 2021. – Vol. 26, № 8. – P. 2237. https://doi.org/10.3390/molecules26082237

13. CYP51 from Trypanosoma brucei is obtusifoliol-specific / G. I. Lepesheva [et al.] // Biochemistry. – 2004. – Vol. 43, № 33. – P. 10789–10799. https://doi.org/10.1021/bi048967t

14. Schenkman, J. B. Spectral analyses of cytochromes P450 / J. B. Schenkman, I. Jansson // Methods Mol. Biol. – 2006. – Vol. 320. – P. 11–18. https://doi.org/10.1385/1-59259-998-2:11

15. The structure of Mycobacterium tuberculosis CYP125: molecular basis for cholesterol binding in a P450 needed for host infection / K. J. McLean [et al.] // J. Biol. Chem. – 2009. – Vol. 284, № 51. – P. 35524–35533. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.032706

16. Biosynthetic studies of marine lipids. 42. Biosynthesis of steroid and triterpenoid metabolites in the sea cucumber Eupentacta fraudatrix / T. N. Makarieva [et al.] // Steroids. – 1993. – Vol. 58, N 11. – P. 508–517. https://doi.org/10.1016/0039-128x(93)90026-j

17. Cyclic steroid glycosides from the starfish Echinaster luzonicus: Structures and immunomodulatory activities / A. A. Kicha [et al.] // J. Nat. Prod. – 2015. – Vol. 78, N 6. – P. 1397–1405. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.5b00332

18. Six new polyhydroxysteroidal glycosides, anthenosides S1–S6, from the starfish Anthenea sibogae / A. A. Kicha [et al.] // Chem. Biodiver. – 2018. – Vol. 15, № 3. – P. 1–12. https://doi.org/10.1002/cbdv.201700553

19. Unusual polyhydroxylated steroids from the starfish Anthenoides laevigatus, collected of the coastal waters of Vietnam / A. A. Kicha [et al.] // Molecules. – 2020. – Vol. 25, № 6. – P. 1–12. https://doi.org/10.3390/molecules25061440

20. Granulatosides D, E and other polar steroid compounds from the starfish Choriaster granulatus. Their immunomodulatory activity and cytotoxicity / N. V. Ivanchina [et al.] // Nat. Prod. Res. – 2019. – Vol. 33, № 18. – P. 2623–2630. https://doi.org/10.1080/14786419.2018.1463223

21. Highly hydroxylated steroids of the starfish Archaster typicus from the Vietnamese waters / N. V. Ivanchina [et al.] // Steroids. – 2010. – Vol. 75, № 12. – P. 897–904. https://doi.org/10.1016/j.steroids.2010.05.012

22. Tabakmakher, K. M. New trisulfated steroids from the Vietnamese marine sponge Halichondria vansoesti and their PSA expression and glucose uptake inhibitory activities / K. M. Tabakmakher [et al.] // Mar. Drugs. – 2019. – Vol. 17, № 8. – P. 445. https://doi.org/10.3390/md17080445

23. Biosensor‐surface plasmon resonance methods for quantitative analysis of biomolecular interactions / F. A. Tanious [et al.] // Methods Cell Biol. – 2008. – Vol. 84. – P. 53–77. https://doi.org/10.1016/S0091-679X(07)84003-9

24. Lipschultz, C. A. Experimental design for analysis of complex kinetics using surface plasmon resonance / C. A. Lipschultz, Y. Li, S. Smith-Gill // Methods. – 2000. – Vol. 20, № 3. – P. 310–318. https://doi.org/10.1006/meth.1999.0924

25. Schenkman, J. B. Substrate interaction with cytochrome P-450 / J. B. Schenkman, S. G. Sligar, D. L. Cinti // Pharmacol. Ther. – 1981. – Vol. 12, № 1. – P. 43–71. https://doi.org/10.1016/0163-7258(81)90075-9

26. Podust, L. M. Crystal structure of cytochrome P450 14α-sterol demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors / L. M. Podust, T. L. Poulos, M. R. Waterman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – Vol. 98, № 6. – P. 3068–3073. https://doi.org/10.1073/pnas.061562898

27. Metabolic fate of human immunoactive sterols in Mycobacterium tuberculosis / T. Varaksa [et al.] // J. Mol. Biol. – 2021. – Vol. 433, № 4. – P. 1–16. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2020.166763

28. Identification of Mycobacterium tuberculosis enzyme involved in vitamin D and 7-dehydrocholesterol metabolism / A. V. Vasilevskaya [et al.] // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2017. – Vol. 169. – P. 202–209. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2016.05.021