Стабильность 5'-диметокситритильной защитной группы синтетического олигонуклеотида в условиях полимеразной цепной реакции

Модификация 5-OH группы нуклеиновых кислот заместителями с различными физико-химическими свойствами имеет принципиальное значение для молекулярной биологии. Интересным представляется исследование симметричного и асимметричного замещения 5'-гидроксила двуцепочечной ДНК (дцДНК) 4,4'-диметок-ситритильной (ДМТ) группой. Симметричное замещение может позволить осуществлять селективное лигирование дцДНК в плазмидный вектор после ее сборки из олигонуклеотидов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) по сравнению с побочными укороченными продуктами сборки. Синтез асимметрично меченной 5'-ДМТ дцДНК при условии наличия специфичной к модификациям 5'-конца экзонуклеазы позволит получать протяженную синтетическую оцДНК, применяемую для сайт-специфичного включения гена в геном с использованием технологии CRISPR/ Cas9. Чтобы провести подобные исследования необходимо выяснить, стабилен ли синтетический 5'-ДМТ олигонуклеотид в условиях ПЦР. B данной работе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ (260 нм) и масс-спектрометрической детекцией мы показали, что 5'-ДМТ-группа стабильна в составе синтетического олигонуклеотида в условиях ПЦР, однако присутствие тиольных соединений может снижать выход 5'-ДМТ-дцДНК. Мы планируем дальнейшее изучение влияния 5'-ДМТ-группы в составе синтетических ДНК на функционирование различных ферментов.

1. Versatile 5'-functionalization of oligonucleotides on solid support: amines, azides, thiols, and thioethers via phosphorus chemistry / G. P. Miller [et al.] // J. Org. Chem. - 2004. - Vol. 69, N 7. - P. 2404-2410. https://doi.org/10.1021/jo035765e

2. Enzymatic synthesis of RNAs capped with nucleotide analogues reveals the molecular basis for substrate selectivity of RNA capping enzyme: impacts on RNA metabolism / M. Issur [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, N 9. - P. e75310. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0075310

3. RNA interference and chemically modified small interfering RNAs / M. Manoharan // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2004. -Vol. 8, N 6. - P. 570-579. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2004.10.007

4. The synthesis of isopropylidene mRNA cap analogs modified with phosphorothioate moiety and their evaluation as promoters of mRNA translation / M. Warminski [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2013. - Vol. 23, N 13. - P. 37533758. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2013.05.001

5. Potential therapeutic applications of RNA cap analogs / M. Ziemniak [et al.] // Future Med Chem. - 2013. - Vol. 5, N 10. - P. 1141-1172. https://doi.org/10.4155/fmc.13.96

6. In vitro synthesis of gene-length single-stranded DNA / R. Veneziano [et al.] // Sci. Rep. - 2018. - Vol. 8, N 1. -P. 6548. https://doi.org/10.1038/s41598-018-24677-5

7. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases / F. Chen [et al.] // Nat. Methods. - 2011. - Vol. 8, N 9. - P. 753-755. https://doi.org/10.1038/nmeth.1653

8. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems / L. Cong [et al.] // Science. - 2013. - Vol. 339, N 6121. -P. 819-823. https://doi.org/10.1126/science.1231143

9. Homology-directed repair of DNA nicks via pathways distinct from canonical double-strand break repair / L. Davis [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2014. - Vol. 111, N 10. - P. E924-932. https://doi.org/10.1073/pnas.1400236111

10. Homologous recombination between single-stranded DNA and chromosomal genes in Saccharomyces cerevisiae / J. R. Simon [et al.] // Mol. Cell. Biol. - 1987. - Vol. 7. N 7. - P. 2329-2334. https://doi.org/10.1128/mcb.7.7.2329

11. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme / L. K. Wang [et al.] // EMBO J. -2002. - Vol. 21, N 14. - P. 3873-3880. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf397

12. Heat-labile phosphatase simplifies the preparation of dephosphorylated vector DNA / L. M. Hoffman [et al.] // Gene. -1990. - Vol. 88, N . - P. 97-99. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90064-x

13. Синтетические нуклеиновые кислоты. Получение и перспективы терапевтического применения / Т. С. Орец-кая [и др.]. - М.: МГУ, 2015. - 102 c.

14. Purification of crude DNA oligonucleotides by solid-phase extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography / M. Gilar [et al.] // J. Chromatogr A. - 2000. - Vol. 890, N 1. - P. 167-177. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(00)00521-5

15. Programmed assembly of long DNA synthons: design, mechanism, and online monitoring / V. V. Shchur [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2019. - Vol. 103, N 21-22. - P. 9103-9117. https://doi.org/10.1007/s00253-019-10099-4

16. Characterization of Synthetic Oligonucleotides Using Agilent LC/MS Systems [Electronic Resource] // Agilent Technologies. - Mode of access: https://www.gimitec.com/file/5990-3539EN.pdf. - Date of access: 18.09.2020.

17. Solid-Phase Oligodeoxynucleotide Synthesis: A Two-Step Cycle Using Peroxy Anion Deprotection / A. B. Sierzchala [et al.] // Journal of the American Chemical Society. - 1998. - Vol. 125, N. 44. - P. 13427-13441. https://doi.org/10.1021/ja030376n